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(液體灌裝泵)凝膠層析技術介紹

時間:2021-06-09 14:29 點擊:
本文綜述了凝膠層析技術的定義原理,相關參數和實驗操作步驟,以及一般應用和優缺點等五個方面。 
關鍵詞:凝膠層析  原理   參數  實驗操作流程  應用  優缺點 
   前言:凝膠層析又稱為分子篩層析或凝膠過濾。它是以多孔性凝膠填料為固定相,按分子大小順序分離樣品中各個組分的液相色譜方法。具有分子篩作用的物質很多,如浮石、瓊脂、瓊脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝膠等。以葡聚糖凝膠應用**廣,商品名是sephadex型號很多,從G10到G200。凝膠層析技術廣泛用于生物化學,高分子化學等眾多領域。凝膠層析技術具有設備簡單、操作方便、分離迅速及不影響分子生物學活性等優點。 (一)凝膠層析原理 
凝膠是一種多孔性的不帶表面電荷的物質,單個凝膠珠本身象個"篩子”,不同類型凝膠的篩孔的大小不同。當帶有多種成分的樣品溶液在凝膠內運動時,由于它們的分子量不同而表現出速度的快慢,在緩沖液洗脫時,分子量大的物質不能進入凝膠孔內,而在凝膠間幾乎是垂直的向下運動,而分子量小的物質則進入凝膠孔內進行“繞道”運行,這樣就可以按分子量的大小,先后流出凝膠柱,達到分離的目的 (二)凝膠層析相關參數 
2.1外水體積、內水體積、基質體積、柱床體積、洗脫體積    外水體積是指凝膠柱中凝膠顆粒周圍空間的體積,也就是凝膠顆粒間液體流動相的體積。內水體積是指凝膠顆粒中孔穴的體積,凝膠層析中固定相體積就是指內水體積。基質體積是指凝膠顆粒實際骨架體積。而柱床體積就是指凝膠柱所能容納的總體積。洗脫體積是指將樣品中某一組分洗脫下來所需的洗脫液的體積。 2.2分配系數 
分配系數是指某個組分在固定相和流動相中的濃度比。對于凝膠層析,分配系數實質上表示某個組分在內水體積和在外水體積中的濃度分配關系。 2.3排阻極限 
排阻極限是指不能進入凝膠顆粒孔穴內部的**小分子的分子量。所有大于排阻極限的分子都不能進入凝膠顆粒內部,直接從凝膠顆粒外流出,所以他們同時被**先洗脫出來。 2.4分級分離范圍 
分級分離范圍表示一種凝膠適用的分離范圍,對于分子量在這個范圍內的分子,用這種凝膠可以得到較好的線性分離。 2.5吸水率和床體積 
吸水率是指1g干的凝膠吸收水的體積或者重量,但它不包括顆粒間吸附的水分。 2.6凝膠顆粒的大小 
層析用的凝膠一般都是球形,顆粒大小通常以目數(mesh)或者顆粒直徑(m)來表示。柱子的分辨率和流速都與凝膠顆粒大小有關。顆粒大,流速快,但分離效果差;顆粒小,分離效果好,但流速慢。一般比較常用的是100-200目。 (三)試驗操作流程 
1.凝膠的選擇  根據層析物質分子量的大小選擇不同型號的凝膠。 
2.凝膠的預處理  稱取適量的凝膠加入過量的緩沖液在冰箱(或室溫)中充分膨脹,或在沸水中煮,膨脹時間應根據不同型號的凝膠而定。在預處理的過程中為使粒子均勻一致需進行浮選,即加入凝膠粒子后,輕輕攪拌,靜置20min,傾去沉淀的粒子,如此反復數次即可。 3.裝柱  層析柱的選擇一般根據分離樣品的種類和樣品的數量而定。純化蛋白質時,柱床體積應為樣品體積的25~100倍。去鹽、游離熒光素約為樣品體積的4~10倍。柱太長或是太短都影響分離效果,而且層析柱的內徑和高度應有一定的比例。    根據經驗,組別分離時,大多采用2-30cm長的層析柱,分級分離時,一般需要100cm左右長的層析柱,其直徑在1-5cm范圍內,小于1cm產生管壁效應,大于5cm則稀釋現象嚴重。長度L與直徑D的比值L/D一般宜在7-10之間,但對移動慢的物質宜在30-40之間。 
4. 加樣與洗脫  樣品體積不宜過多,**好為床體積的1%~5%,**多不要超過10%。樣品濃度也不宜過大,濃度過大粘度大,分離效果差,一般不超過4%。洗脫液應與膨脹一致,否則更換溶劑,凝膠體積會發生變化,影響分離效果。洗脫液要有一定的離子強度和pH值。 5.洗脫液收集 樣品加入后打開流出口,使樣品滲入凝膠床內,當樣品液面恰與凝膠床表面相平時,再加入數毫升洗脫液中洗管壁,使其全部進入凝膠床后,將層析床與洗脫液貯瓶及收集器相連,預先設計好流速,然后分部收集洗脫液,并對每一餾份做定性、定量測定。 6.凝膠柱的重復使用與保存  一次裝柱后可以反復使用,不必特殊處理,并不影響分離效果。為了防止凝膠染菌,可在一次層析后加入0.02%的疊氮鈉,在下次層析前應將抑菌劑除去,以免干擾洗脫液的測定。   
    如果不再使用可將其回收,一般方法是將凝膠用水沖洗干凈濾干,依次用70%、90%、95%乙醇脫水平衡**乙醇濃度達90%以上,濾干,再用乙醚洗去乙醇、濾干、干燥保存。濕態保存方法是凝膠漿中加入抑菌劑或水沖洗到中性,密封后高壓滅菌保存。 (四)凝膠層析的應用 
⑴ 脫鹽:高分子(如蛋白質、核酸、多糖等)溶液中的低分子量雜質,可以用凝膠層析法除去,這一操作稱為脫鹽。本法脫鹽操作簡便、快速、蛋白質和酶類等在脫鹽過程中不易變性。適用的凝膠為SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6。柱長與直徑之比為5-15,樣品體積可達柱床體積的25%-30%,為了防止蛋白質脫鹽后溶解度降低會形成沉淀吸附于柱上,一般用醋酸銨等揮發性鹽類緩沖液使層析柱平衡,然后加入樣品,再用同樣緩沖液洗脫,收集的洗脫液用冷凍干燥法除去揮發性鹽類。    
 

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